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技術知識

使用超聲波破碎細胞的相關問題

來源:本站  發布時間:2018-10-21 22:42:04 點擊量:263

眾所周知,儀器設備在使用過程中或多或少都會遇到一些狀況,當然超聲波細胞破碎儀也不例外,下面由我們凈信來為大家介紹下超聲波細胞破碎儀的常見問題:

大腸桿菌表達外源蛋白,在超聲破碎的時候,用含有1%triton-X-100的PBS懸浮,然后超聲的效果較好,1%triton-X-100的作用還是很明顯的,對其他的一些細菌同樣起作用,比如鏈霉菌。

細菌沉淀直接加樣品1buffer,再加5ul的巰基乙醇,混勻,離心,煮沸10min,直接上樣,染色脫色步驟如下:將膠放入適量的染色液微波爐里加熱1min(下次適當補點醋酸即可),將染色液換成大量的水(自來水即可)在微波爐煮10min 就可以。

在表達重組蛋白后超聲波破碎細胞,采用冰浴,400w,破2s停1s,但是不一會就產生大量泡沫,影響了破碎功率,pbs和tris緩沖液都是這樣,最后都是破碎不完全,而我的目的蛋白就在這些未破碎的細胞中。

  • 1*會產生氣泡是因為你的探頭位置沒放好。探頭一定要接近底部,約1cm(我一般是距底部0.5mm)。功率根據儀器不同會有所不同,但你可以觀察液面,有波動但不要太劇烈就好。
  • 2*破3S停10S,破個二三十次看看。
  • 3*變幅桿位置擺放也要注意,聽聲音如果不對的話就要及時調整。另外可以從菌濃度方面考慮。 在破碎時,試著加大體積,強度最好不要超過60%.
  • 4*嘗試超8s停8s,對有些菌體蛋白來說,你的方法很難散熱,導致蛋白變性產生氣泡,最好停頓時間稍長一些,這種情況多見于包涵體形式的蛋白。

鏈霉菌(放線菌)超聲破碎的,用的方法條件是什么?前處理一般就是配置成一定濃度的菌懸液。使用超聲破碎時采用的具體條件是:

  • (1)取細菌的24 h培養液于5 000 r/min 下離心5 min收集菌體.
  • (2)用pH 7.5的Na2HPO -NaH2PO 緩沖液洗滌3次,再用該緩沖液將菌體配成1:3的菌懸液.置于40mL大塑料試管內.
  • (3)將大塑料試管置于冰浴中,采用超聲波破碎(功率200 W,1/2”探頭,破碎30 s,間歇30 S).
  • (4)破碎液于12 000 r/min下高速冷凍離心30 min,收集細胞碎片和上清夜.

超聲破菌流程與 上述基本一致,就是洗滌菌體也可以用預冷的生理鹽水或pH8的Tris-HCl,洗滌一次就可以。另外,超聲劑量隨樣品量、菌體改變比較大,功率可以到400-600w,超5s,停5s,冰浴,要加終濃度1 mM的PMSF。為確定合適的超聲強度和次數,有必要隨時鏡檢觀察菌體是否完全破碎。

放線菌屬于原核生物系統進化樹上的(G+C)摩爾百分含量(mol%)高的革蘭氏陽性菌(Eubacteria)分枝類群,它雖然具有原核生物特有的分子生物學特性,但在其不同類群中,細胞壁的化學組分變化很大。

在做大腸桿菌超聲時,采用的是400W,超5停5的方法,效果不錯,但是用在鏈霉菌上,似乎沒什么效果。會不會就是由于細胞壁組成差異造成的呢,因為大腸桿菌式屬于革蘭氏陰性菌的。

再有鏡檢是檢驗破碎效果,但是細胞破碎程度和我需要的酶獲得之間有正比關系嗎?破碎時間長也會影響到酶的活性。所以想問問anaisai戰友,你提供的“功率200 W,1/2”探頭,破碎30 s,間歇30 S”的條件好像是用于破碎鏈霉菌孢子的,也可以用于發酵離心后的菌泥嗎?如果可以,你破碎的全程時間大概是多少呢? 

如果你需要的是胞內酶,細胞破碎程度和需要的酶獲得之間基本上有正比關系。破碎時間長的確會影響到酶的活性。這就需要在最佳的破碎時間和酶活性之間做出判斷,最直接的辦法是先繪制相關曲線(酶活性和時間的關系曲線)。

實驗中,破碎的是棒狀桿菌(也是很難破壁的G+菌),破碎時間控制在30min左右,酶活較好。 如果是基質菌絲的話,好可以考慮用溶菌酶處理一下.一般來講這幾種方法讀可以的:

  • 一,液氮研磨
  • 二,用french press破碎
  • 三,超聲波破碎
  • 四,溶菌酶處理預處理

超聲波是物質介質中的一種彈性機械波,它既是一種波動形式,又是一種能量形式。超聲對細胞的作用主要有熱效應,空化效應和機械效應。熱效應是當超聲在介質中傳播時,摩擦力阻礙了由超聲引起的分子震動,使部分能量轉化為局部高熱(42-43℃)??栈窃诔曊丈湎?,生物體內形成空泡,隨著空泡震動和其猛烈的聚爆而產生出機械剪切壓力和動蕩。另外,空化泡破裂時產生瞬時高溫(約5000℃)、高壓(可達500×104Pa),可使水蒸氣熱解離產生.OH自由基和.H原子,由.OH自由基和.H原子引起的氧化還原反應,可導致多聚物降解、酶失活、脂質過氧化和細胞殺傷。機械效應是超聲的原發效應,超聲波在傳播過程中介質質點交替地壓縮與伸張構成了壓力變化,引起細胞結構損傷。損傷作用的強弱與超聲的頻率和強度密切相關。100g大腸桿菌溶于1L破碎液里(破碎掖:50mM Tris-Cl(PH8.5) 5mM EDTA 0.14M NaCl),攪拌,發現菌液發粘,菌體不能夠很好分散,用高壓勻質機破碎,加壓后,菌液不能進入勻質機,速度很慢,

請問是何原因?能有好的辦法解決,很好用勻質機快速破碎菌體?

將破碎液的量加大,不能很好分散可能是量太大 。超聲處理5-10分鐘,菌液粘度即可大大降低,也可促進菌體分散。不同型號的設備功率不一樣,功率的大小決定了使用變幅桿的大小范圍(直徑2mm至幾十毫米),你使用多大的變幅桿就在設備的上調至該刻度(很簡單的)!變幅桿的大小決定了處理量5ml一下選3mm,5~50ml可選6~8mm,50ml以上選10mm的變幅桿,依此類推!占空比不用關心的,主要是指超聲時間和停頓時間的比值。 

酵母破碎的問題

一般的PROTOCOL都是用glass beads  破碎酵母細胞sigma G-8772 酵母破碎效果好的我所做過的方法中還是玻璃珠,效率很高,而且對目的蛋白活性不會有什么影響。一般應該用這個方法。

化學裂解的方法,10g酵母 加1ml的乙酸乙酯,充分攪拌至液體狀。此法的裂解效果不錯的加尿素裂解液(尿素8mol/L, NaCl 0.5mol/L,Tris 20mmol/L, EDTA 20mmol/L, 2%SDS, PH值8.0),據說效果可以。

畢氏酵母細胞破碎法

在破碎遇到的問題是菌體濃度太低,OD620nm在4-6之間。細胞破碎儀的最低破碎體積為4ml左右,這樣再稀釋一倍,OD就到2-3啦,我們懷疑破碎完溶出蛋白和酶活測定時會測不準。所以請教大家細胞破碎時,最低的菌濃多少為下限?我們的菌是一種棒桿菌。 破碎后,你可將液體放入透析袋中濃縮。

我們所做的方法是按照1:20的比例將離心后的菌體(e.coli)溶解于超聲緩沖液(50mM 磷酸 pH8.0 )300w 10s/10s 破碎20分鐘。做了鏡檢!基本全被破碎了!我做蛋白純化的,做的包涵體。實驗中,我們的菌體濃度相對獨立,與培養液中的菌體od無關,不收其限制,便于操作者調控。一般按每g濕菌體加5-10ml裂菌緩沖液。超聲肯定會產熱,所以一定要有降溫裝置,除非你需要得成分耐高溫。

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